Pengertian HPLC

HPLC

HPLC adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya.Membingungkan, ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Meskipun disebut sebagai “normal”, ini bukan merupakan bentuk   yang    biasa    dari  HPLC. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm. Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan   lebih     cepat    melewati     kolom. Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat     dalam  kolom.Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom. Fase balik HPLC adalah bentuk yang biasa digunakan dalam HPLC. 

Injeksi sampel
         Injeksi sample seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).

Waktu   retensi
         Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari senyawa itu. Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:

• tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
• kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
• komposisi yang tepat dari pelarut
• temperatur pada kolom

Itu berarti bahwa kondisi harus dikontrol secara hati-hati, jika anda menggunakan waktu retensi sebagai sarana untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa.

Detektor
         Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV. Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.
Anda juga dapat menggunakan puncak sebagai jalan untuk mengukur kuanti?tas dari senyawa yang dihasilkan. Mari beranggapan bahwa tertarik dalam senyawa tertentu, X.Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Instrumentasi Peralatan HPLC

1.      Wadah fase gerak

Wadah fase gerak terbuat dari bahan yang inert terhadaop fase gerak .bahan yang umum digunakan adalah stainless steel atau gelas.daya tampung 500 ml atau 100 ml.sebelum fase gerak dimasukkan kedalam wadah ,fase gerak harus disaring terlebih dahulu. Hal ini mungkin mencegah tersumbatnya kolom atau katup dengan partikel-partikel asing. Setelah selanjutnyya dibebaskan dari gas yg terlarut didalamnya dengan teknik pengadukkan di dalam vakum ,pendesakan dengan gas yang inert atau dengan pengantaran dalam ultrasonik ceiner.Wadah fasa gerak dilengkapi dengan tutup  dan pipa yang menghubungkan ke pompa.

2.       Pompa

Pompa tebuat dari bahan yang inert terhadap fase gerak yang digunakan terbuat dari stainlees steel dan teplok .pompa dugunakan mampu menghasilkan tekanan sampai 500 Psi pada kecepatan aliran sampai 3 ml/menit. Pompa aliran tetap tetap gerak ganda menghasilkan tekanan maksimum 400 bar dengan range kecepatan alir 0,01 – 9,90 ml/menit,pompa tekanan tetap pneumatik amplifier menghasilkan tekanan maksimum 500 bar dengan range kecepatan alir sampai 200 ml/menit .Aliran pelarut dari pompa harus tanpa denyut untuk menghindari hasil yang menyimpang pada berbagai detektor.

3.     Unit Injeksi

Pengantar sampel ke kolom dibagi dua yaitu : Pertama memasukkan sampel dengan mikro liter melalui sekat karet pada unit injeksi dengan atau tanpa perhentian aliran. Cara kedua ,dengan menggunakn injektor atau disebut juga katup penyuktik keluk dan lup value. Pada cara yang pertama ,volume yang akan diinjeksikan harus telah terukur sedang pada cara yang kedua volume dapat lebih dari kapasitas injeksi maka sampel akan diinjeksikan oleh injektor dengan dorongan fase gerak masuk kedalam kolom.

3.      Kolom

Kolom yang umum igunakan terbuat dari stainless still,panjangnya bermacam-macam 10; 12,5 ; 15; dan 25 cm,diameter didalamnuya 3 ; 6,2 ;atau 9 mm.kolom dikemas dengan partikel silika dengan ukuran diameter 3 ; 5 atau 10 mm silika-silika mikro partikel ini telah digunakan dengan berbagai macam tujuan dalam HPLC,seperti :

a.      Adsoebent pada kromatografi padat cair

b.      Bahan pendukung untuk kromatografi cair-cair.

c.       Sebagai fase terikat dengan mereakikan gugus silianol dengan gugus kimia tertentu.

d.      Sebagai bahan untuk kromatografi eklusi.

4.            Detektor

         Detektor berfungsi untuk memonitor keluarnya solut beserta fase gerak dari kolom output detektor berupa sinyal listrik yang sebanding dengan sifat-sifat fase gerak dan solut .Detektor yang digunakan dalam HPLC secara umum terbagi 3 bagian yaitu :

1.      Detektor sifat bongkah  (detektor differensial ).detektor ini memberikan tanggapan –tanggapan terhadap sifat yang dimiliki oleh solut dan fase gerak.

Contoh : detektor indeks bias.

2.    Detektor sifat zat yang terlarut (detektor selektif ).detektor jenis ini hanya

      tangga terhadap sifat-sifat zat terlarut (solut) yang dimiliki oleh fase gerak.

Contoh : detektor UV=Visibel,detektor pancar (flurisensi).

3.         Detektor yang mengukur sifat analitik setelah fase gerak dihilangkan . Detektor ini merupakan detektor kromatografi gas yang dimodifikasi untuk HPLC.

Contoh : Flame ionisation detector (FID),electro captura detector (ECD).